O jogo se passa nos meses finais do intervalo de 2 anos apresentado na abertura de Jak II (e nas consequências de The Precursor Legacy), entre o momento em que Jak é feito prisioneiro pela Guarda Krimzon e o momento em que Daxter finalmente o resgata da Fortaleza da Guarda Krimzon. A introdução mostra Jak sendo capturado, enquanto Daxter consegue escapar. Quase dois anos depois (não tendo sorte em resgatar Jak), Daxter se esqueceu completamente de como encontrar seu amigo. Um velho chamado Osmo, que Daxter conhece, contrata Daxter como um exterminador trabalhando em várias partes de Haven City, e ocasionalmente em seus arredores, para exterminar Metal Heads semelhantes a insetos, chamados no jogo como ''Metal Bugs''. Durante suas aventuras, Daxter conhece uma mulher misteriosa chamada Taryn que, apesar de não ficar nada impressionada com o interesse de Daxter por ela, ocasionalmente o ajuda.
Depois de completar uma série de missões para Osmo, Daxter vê Jak em um Prison Zoomer e tenta persegui-lo. Depois de ser encurralado por alguns Guardas Krimzon (que notaram a perseguição de Daxter), Daxter é resgatado pelo filho de Osmo, Ximon, que o ajuda em várias outras missões, incluindo uma no palácio do Barão Praxis, onde Daxter rouba um mapa da Fortaleza, a prisão onde Jak está sendo realizada. Depois de retornar à loja de extermínio, um companheiro artrópode que Daxter adquiriu anteriormente é morto por Kaeden, um homem amargo que aparentemente quer roubar a loja de Osmo, mas, na verdade, está trabalhando para Kor, o líder do Metal Head.
Quando Daxter tenta impedir Kaeden de escapar da loja, Kaeden de repente explode a loja com uma bomba que ele colocou na loja antes. Daxter e Osmo sobrevivem, e Daxter promete impedir Kaeden, mas somente depois de resgatar Jak. Daxter se infiltra na Fortaleza e encontra Kaeden, que se revela um Metal Bug gigante. Daxter consegue derrotar Kaeden, que tenta avisá-lo que Kor está esperando por eles do lado de fora, e então usa uma plataforma flutuante para começar a procurar por Jak dentro da Fortaleza, levando à cena de abertura de Jak II. Depois disso, o jogo corta para um ponto posterior na linha do tempo no Daxter''s Naughty Ottsel Bar, onde ele conta a história para Jak, Keira, Samos, Tess e Taryn.
Daxter está centrado no mundo do adorável ottsel laranja que se tornou popular na franquia Jak and Daxter. A história se desenrola enquanto Daxter procura Jak, que foi preso durante os eventos que levaram ao início de “Jak II”. Daxter, agora sozinho em um lugar desconhecido, rapidamente percebe que ser pequeno e peludo não aumentará suas chances de sobrevivência. Para ajudar a erradicar uma misteriosa infestação de metalbug, Daxter assume um trabalho como exterminador de pragas, o que lhe permite explorar partes de Haven City, num esforço para recolher as pistas que o levarão até Jak. Daxter permite que os jogadores joguem a partir de sua perspectiva, oferecendo um conjunto distinto de movimentos com habilidades ágeis que permitem aos jogadores escalar paredes, subir em inimigos, caber em lugares pequenos e manobrar veículos. Aceitando um emprego como exterminador de pragas para combater uma invasão contínua de insetos metálicos, Daxter vem equipado com dispositivos para livrar a cidade desses incômodos metálicos. Aproxime-se pessoalmente usando seu frágil mata-insetos para esmagar um exército de insetos atacantes ou sua pistola de pulverização para pairar em uma variedade de ambientes enquanto coleta várias atualizações.