DJ Hero simula principalmente turntablism, um estilo musical usado por disc jockeys para criar uma nova música mashup incorporando uma ou mais músicas gravadas anteriormente tocadas em toca-discos junto com geradores de efeitos sonoros. O jogo apresenta jogabilidade de ataque de pontuação semelhante aos jogos Guitar Hero. O controlador consiste em um deck sem fio que consiste em uma plataforma giratória móvel que suporta 3 botões "stream", um dial de efeitos, um crossfader e um botão "Euphoria"; um painel oculto contém botões adicionais do controlador para interagir com o console de jogos fora do jogo. Uma parte do controlador pode ser destacada e recolocada para adaptar a unidade para jogadores canhotos. As notas viajam em um arco através de um registro giratório na tela, e o jogador mantém pressionado um dos 3 botões de fluxo para tocar as notas; dois botões refletem as duas músicas usadas naquela mixagem específica, e o terceiro representa samples a serem adicionados à mixagem que podem ser ajustados com o dial de efeitos. O jogador também deve ajustar constantemente o crossfader para corresponder aos símbolos na tela, o que altera o volume relativo das músicas para trazer uma música para o primeiro plano da mixagem por um curto período de tempo. Certas faixas são mostradas na tela como uma série de setas para cima ou para baixo, representando seções de arranhão, exigindo que o jogador gire a plataforma giratória na direção das setas enquanto mantém pressionado o botão para marcar pontos, imitando o arranhão da agulha do disco no vinil álbuns. "Euphoria" é equivalente ao Star Power do Guitar Hero, coletado ao completar com sucesso frases específicas no mix da música, chamado Perfect Regions, e pode ser liberado pressionando o botão Euphoria, dobrando o multiplicador atual do jogador, bem como o crossfading automático quando ativo. Há também um medidor de "Rebobinar" que aumenta por meio de uma reprodução consistente e bem-sucedida e, uma vez cheio, permite que o jogador rebobine a música para corrigir erros em sua performance. O jogador deve continuar a ter um bom desempenho ou seu medidor de desempenho cairá e a faixa de música será cortada. Errar a música não é possível, ao contrário dos jogos Guitar Hero.
Um modo de carreira para um jogador está disponível, bem como modos multiplayer competitivos e cooperativos ("DJ vs DJ"), jogáveis local ou remotamente. Dez músicas foram especialmente mixadas para também oferecer suporte à jogabilidade com Guitar Hero e outros controladores de guitarra compatíveis no modo "DJ vs Guitar". Os jogadores também podem usar um microfone para uma adição sem pontuação à mistura. Um modo Party Play permite que o jogo reproduza automaticamente as músicas com a capacidade de um jogador entrar e tocar a qualquer momento.