Em uma coletiva de imprensa realizada por Bruce Wayne para declarar sua oposição a Arkham City, os mercenários TYGER o prendem e aprisionam em Arkham City. Hugo Strange revela seu conhecimento da dupla identidade de Wayne como Batman antes de liberá-lo para a população criminosa da prisão. Enquanto Strange se prepara para iniciar o "Protocolo 10", Wayne obtém seu equipamento via lançamento aéreo de Alfred Pennyworth, permitindo que ele se torne o Batman. Ele primeiro salva a Mulher-Gato de ser executada por Duas-Caras, que espera ganhar respeito assassinando-a. Depois que o Coringa tenta assassinar a Mulher-Gato, Batman o rastreia até seu esconderijo na Sionis Steelmill, acreditando que o Coringa pode saber a verdade por trás do Protocolo 10.
Lá, Batman descobre que as propriedades instáveis da fórmula do Titã estão se transformando no sangue do Coringa, matando-o gradualmente. Joker captura Batman e faz uma transfusão de sangue nele, infectando-o com a mesma doença fatal. Joker também revela que os hospitais de Gotham foram envenenados com seu sangue infectado. Desesperado para salvar a si mesmo e a cidadãos inocentes, Batman procura o Sr. Freeze, que estava desenvolvendo uma cura, mas desde então foi sequestrado pelo Pinguim.
Rastreando o Pinguim até o Instituto de História Nacional Cyrus Pinkney, Batman derrota suas forças, seu monstro preso Solomon Grundy e, finalmente, o próprio Pinguim, antes de libertar o Sr. Freeze diz a Batman que já desenvolveu a cura, mas sua instabilidade a torna inútil. Batman deduz que as propriedades restauradoras do sangue de Ra''s al Ghul podem completar a cura. Batman rastreia um dos assassinos de Ra''s al Ghul até seu covil subterrâneo, levando Batman a um confronto com Ra''s e sua filha Talia, ex-amante de Batman. Com o sangue de Ra''s al Ghul, Freeze é capaz de desenvolver um antídoto, mas é roubado por Harley Quinn antes que Batman possa usá-lo.
Quando ele retorna ao Coringa, Batman o encontra com a saúde restaurada. Enquanto os dois lutam, Strange ativa o Protocolo 10, que se revela ser um esquema para acabar com toda a população de Arkham City e destruir o elemento criminoso de Gotham. As tropas TYGER começam a executar prisioneiros enquanto Strange lança ataques com mísseis contra os habitantes de Arkham de sua base na Torre Maravilha. Um míssil atinge a siderúrgica, enterrando Batman sob os escombros. Antes que Joker pudesse tirar proveito da situação, Talia chega e oferece a ele a imortalidade em troca de poupar a vida de Batman. Depois de escapar com a ajuda da Mulher-Gato, Batman é convencido por Alfred a encerrar o Protocolo 10 antes de perseguir Talia e Joker.
Batman se infiltra na Wonder Tower e desativa o Protocolo 10. Ra''s al Ghul é revelado como o verdadeiro mentor por trás de Arkham City e fere mortalmente Strange por não ter conseguido derrotar Batman. Com seu último suspiro, Strange ativa o "Protocolo 11", a autodestruição da Wonder Tower. Batman e Ra''s escapam, mas Ra''s comete suicídio em vez de arriscar a captura. Joker contata Batman, ameaçando matar Talia a menos que Batman o encontre no Monarch Theatre. Assim que Batman chega, Joker exige a cura, mas é esfaqueado e aparentemente morto por Talia enquanto estava distraído. Talia admite ter roubado a cura de Quinn, quando ela é morta por um segundo Coringa, ainda acometido pela doença. O Coringa saudável que Talia esfaqueou então reanima no metamorfo Cara de Barro, que revelou ter se disfarçado como um Coringa saudável o tempo todo a pedido do vilão doente.
Batman incapacita Clayface, mas Joker explode o chão do teatro, fazendo Batman despencar no covil de Ra''s abaixo. Batman destrói o rejuvenescedor Lazarus Pit de Ra antes que o Coringa possa usá-lo e bebe uma porção do antídoto. Batman debate a cura de seu inimigo, mas é atacado por Joker antes que ele possa agir, fazendo com que o frasco do antídoto se quebre inadvertidamente. Batman admite que apesar de tudo que o Coringa fez, ele o teria salvado. Depois que Joker finalmente sucumbe à doença e morre, Batman carrega seu corpo para fora de Arkham City. Enquanto o comissário Gordon pergunta o que aconteceu, Batman coloca o corpo do Coringa no capô de um carro da polícia e sai em silêncio.
Após os eventos de Batman: Arkham Asylum (2009), uma seção da cidade de Gotham foi transformada em uma prisão, projetada para manter a escória da cidade longe das pessoas. Bruce Wayne protesta contra esta prisão, mas logo é sequestrado pelo desprezível Hugo Strange, tendo que enfrentar os vilões mais poderosos da cidade como o Batman enquanto tenta descobrir os planos de Strange.